Adaptación metabólica a la auxotrofia vitamínica por hoja

The ISME Journal volumen 16, páginas 2712–2724 (2022) Citar este artículo

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Los auxótrofos no pueden sintetizar todos los metabolitos esenciales para su metabolismo y dependen de otros para que se los proporcionen. Se han estudiado intensamente en mutantes generados y evolucionados en laboratorio, pero los mecanismos emergentes de adaptación a la auxotrofia no se han abordado sistemáticamente. Aquí, investigamos las auxotrofias en bacterias aisladas de hojas de Arabidopsis thaliana y descubrimos que hasta la mitad de las cepas tienen requisitos auxotróficos de biotina, niacina, pantotenato y/o tiamina. Luego exploramos la base genética de la auxotrofia, así como los rasgos que coincidían con la auxotrofia de las vitaminas. Descubrimos que las cepas auxotróficas generalmente almacenaban coenzimas con la capacidad de crecer exponencialmente de 1 a 3 duplicaciones sin suplementos vitamínicos; sin embargo, el mayor almacenamiento observado fue para biotina, lo que permitió 9 duplicaciones en una cepa. En experimentos de cocultivo, demostramos el suministro de vitaminas a los auxótrofos y descubrimos que las cepas auxótrofas mantuvieron una mayor riqueza de especies que los protótrofos con la suplementación externa con vitaminas. La extensión de un modelo de recursos del consumidor predijo que los auxótrofos pueden utilizar compuestos de carbono proporcionados por otros organismos, lo que sugiere que las cepas auxótrofas se benefician de subproductos metabólicos más allá de las vitaminas.

Las coenzimas son esenciales para el metabolismo celular. Forman el núcleo de muchas reacciones catalizadas por enzimas (p. ej., reacciones redox, transaminaciones y formación de enlaces carbono-carbono) y actúan como transportadores de unidades monocarbonadas y ácidos orgánicos [1]. Los organismos con defectos en su biosíntesis, los auxótrofos, deben obtener coenzimas o moléculas precursoras de coenzimas, es decir, vitaminas por aporte externo. Debido a que dependen del suministro de vitaminas en su entorno para permitir el crecimiento, la inestabilidad de las coenzimas exacerbaría la necesidad de suministro externo. Recientemente se ha demostrado que el esqueleto de carbono de las coenzimas es estable in vivo [2]. De hecho, la longevidad de la coenzima, es decir, la ausencia de degradación y reconstrucción intracelular, es una propiedad inherente que podría haber sido seleccionada evolutivamente [2, 3] y puede considerarse un requisito previo para la proliferación de organismos auxotróficos. Los requisitos auxotróficos pueden evolucionar rápidamente en experimentos de evolución de laboratorio en medios ricos en nutrientes, como se muestra en las poblaciones de Escherichia coli [4]. Las cepas auxotróficas también se han aislado de la naturaleza y, a menudo, son el resultado de la pérdida de genes [5,6,7]. Sin embargo, actualmente no está claro cuán comunes son las auxotrofias en bacterias en la mayoría de los entornos. Varios estudios recientes informaron predicciones sobre los requisitos nutricionales directamente a partir de datos genómicos utilizando modelos metabólicos a escala del genoma o identificando brechas en los genomas sin validación experimental [8,9,10,11,12,13] o enfocando la validación experimental a unos pocos cepas [14,15,16]. Estos estudios se han utilizado para predecir las redes de interacción de las comunidades microbianas, que a su vez han servido para inferir la alimentación cruzada metabólica en las comunidades bacterianas [17]. La frecuencia de auxotrofias para coenzimas, nucleobases y aminoácidos en bacterias secuenciadas se estimó en análisis computacionales y podría llegar al 75 % [13], aunque es probable que estos análisis muestren una alta tasa de falsos positivos en comparación con los datos obtenidos experimentalmente [ 18].

Los auxótrofos requieren un suministro externo de vitaminas, lo que plantea la cuestión de las adaptaciones fisiológicas o de otro tipo de los auxótrofos, incluido el almacenamiento de vitaminas. Se sabe desde hace mucho tiempo que las bacterias auxotróficas del ácido láctico mantienen el crecimiento después de la eliminación de las vitaminas [19]. Aunque se ha demostrado el almacenamiento intracelular de compuestos elementales como el carbono, el fósforo y el nitrógeno [20,21,22], el almacenamiento de moléculas pequeñas, incluidas las vitaminas y las coenzimas, actualmente no está bien establecido. Tampoco está claro cuán generalizado es el almacenamiento potencial en las bacterias ambientales. Existe un renovado interés por evaluar el almacenamiento de diversos compuestos debido a las implicaciones ecológicas de la capacidad de los microbios para mantener el crecimiento sin acceso externo a los recursos [23]. Las cepas prototróficas de E. coli que fueron mutadas en genes implicados en la biosíntesis de coenzimas, es decir, mutantes auxotróficos "artificiales", tienen una capacidad de almacenamiento de sólo una duplicación después de la eliminación de la vitamina esencial [2]. Este doble exceso de coenzimas es probablemente el requisito mínimo para mantener el metabolismo robusto frente a la expansión celular durante la división celular. Estos resultados nos llevaron a plantear la hipótesis de que para los auxótrofos que se encuentran en la naturaleza, donde el suministro de coenzimas puede ser errático, pueden haber evolucionado diferentes estrategias para hacer frente a la dependencia de nutrientes y al almacenamiento de coenzimas. La pérdida de biosíntesis de un compuesto también podría afectar la función de una célula de una manera más sistémica. Las consecuencias fisiológicas directas resultantes de la pérdida de la biosíntesis se han estudiado en organismos modelo como E. coli, Bacillus subtilis y Acinetobacter baylyi e incluyen beneficios para la aptitud física [4, 13, 24] y potencial de alimentación cruzada [25, 26]. Estos estudios muestran que, siempre que el nutriente requerido esté disponible, los auxótrofos superan al tipo salvaje. Se puede anticipar que, dado el tiempo evolutivo suficiente, se pueden seleccionar otros rasgos para compensar la pérdida de una capacidad biosintética. Esta pérdida de una función esencial, por ejemplo, una ruta biosintética particular, puede extenderse luego a otros compuestos que están disponibles en el nicho ahora obligatorio, así como a características que ayudan a lidiar con la escasez de nutrientes. Esto último podría implicar, por ejemplo, optimizar el uso de coenzimas auxotróficas en las vías metabólicas, aumentar el almacenamiento de vitaminas, invertir más energía en los sistemas de reparación u optimizar el crecimiento y las tasas de absorción de nutrientes [9, 27, 28, 29].

Aquí, primero investigamos la aparición de auxotrofias en la colección At-LSPHERE, que consta de 224 cepas aisladas de hojas de plantas de Arabidopsis thaliana que crecen en la naturaleza [30]. Las cepas se habían aislado en un medio repleto de vitaminas y aminoácidos, lo que permite experimentos sistemáticos de abandono de nutrientes para examinar las auxotrofias dentro de la colección de cepas. Luego, abordamos si las cepas auxotróficas mantienen un almacenamiento de coenzimas más alto que las cepas prototróficas y exploramos los rasgos genómicos que ocurren (y potencialmente coevolucionaron) con la auxotrofia. Finalmente, examinamos la adquisición de vitaminas y la aptitud auxotrófica en experimentos de cocultivo.

Para identificar las cepas auxotróficas para este estudio, seleccionamos una colección de cepas representativas de 224 miembros (At-LSPHERE) [30]. Brevemente, se cultivaron triplicados de cada cepa en placas de 96 pocillos llenas de medio líquido suplementado con vitaminas o aminoácidos, con ambos tipos de compuestos, o sin suplementos. Se utilizaron mediciones de densidad óptica de alto rendimiento (OD600) como lectura del crecimiento. Descubrimos que de las 156 cepas que crecieron en el medio, el 50% (78) requería suplementos para el crecimiento y, por lo tanto, probablemente eran auxotróficas (Fig. 1 complementaria). La auxotrofia fue especialmente común en Actinobacteria y Alphaproteobacteria, de las cuales más de la mitad de las cepas analizadas eran auxotróficas. De estas 78 cepas, seleccionamos 50 auxótrofos putativos para una caracterización adicional en medios de exclusión individuales y descubrimos que la mayoría de los auxótrofos de vitaminas eran para biotina, tiamina, niacina y pantotenato para los cuales encontramos 10 o más auxótrofos cada uno (Fig. 1a; Complementario Figura 1).

a Auxotrofias vitamínicas concurrentes según se infiere de la falta de crecimiento sin una vitamina dada en un tamizaje en medios de abandono para 50 cepas. La niacina, el pantotenato, la biotina y la tiamina fueron las vitaminas más requeridas. El grosor del borde corresponde al número de deformaciones en las que coexisten las dos supuestas auxotrofias. PABA = ácido para-aminobenzoico. (Datos de origen en Datos de origen 1.) b Experimentos dinámicos representativos de agotamiento de vitaminas. El crecimiento se presenta como duplicaciones a lo largo del tiempo. En t = 0, se realizó un cambio de precultivo suplementado con las cuatro vitaminas a un medio sin vitaminas (líneas coloreadas) o, como control, medio suplementado (línea negra). Si una cepa era auxotrófica para una vitamina determinada, agotaba esa vitamina después de un tiempo y dejaba de crecer; por ejemplo, Aureiomonas Leaf324 se encontró auxotrófica para las cuatro vitaminas. El punto de tiempo en el que se desviaron los cultivos suplementados y empobrecidos en vitaminas se visualiza en el gráfico de líneas para las tres réplicas por separado (consulte Materiales y métodos para obtener más información). (Datos de origen en Datos de origen 2.) c Mapa de calor de auxotrofia. El color claro se refiere a los compuestos sin los cuales el crecimiento de una cepa se desvía del control suplementado y, por lo tanto, la cepa es auxotrófica. Por ejemplo, para Aureiomonas Leaf324, las 4 columnas de agotamiento son de color gris claro ya que su crecimiento cesó sin cada uno de los compuestos individualmente. (Datos de origen en Datos de origen 3.) d Almacenamiento de coenzimas en cepas auxotróficas (rango intercuartílico y mediana). El número de duplicaciones en ausencia de la vitamina indicada corresponde a la capacidad de almacenamiento. (Datos de origen en Datos de origen 3).

Datos de origen 1Datos de origen 2Datos de origen 3Datos de origen 3.

Aunque es útil para caracterizar los requisitos de nutrientes de muchas cepas en paralelo, la aplicación de una pantalla para dilucidar los requisitos de nutrientes de una cepa individual está limitada debido al rango lineal de los lectores de placas, lo que podría conducir a predicciones falsas. Para superar esta limitación y para un análisis posterior, seleccionamos 22 cepas de varios filos que no formaron agregados al crecer en medios líquidos, lo que aseguramos visualmente y confirmamos que sus recuentos de unidades formadoras de colonias estaban dentro del rango esperado (orden de 1e9 /ml) (Tabla complementaria 1; consulte las cepas seleccionadas en la Tabla complementaria 2). Cultivamos cada cepa en cultivos por lotes semicontinuos y monitoreamos la DO600 a intervalos de 10 minutos, diluyendo cada pocillo con medio nuevo después de cada dos duplicaciones para garantizar un crecimiento exponencial continuo. Usamos estos datos para examinar el crecimiento de cada una de las cepas en medios mínimos de glucosa suplementados con biotina, niacina, tiamina y pantotenato, y observamos que todas las cepas crecieron en presencia de estas cuatro vitaminas (trayectorias negras en la Fig. 1b y la Fig. Suplementaria). . 2). Posteriormente, realizamos experimentos de crecimiento cambiando las células a medios sin vitaminas (ver Métodos), exponiendo así las células al agotamiento de las vitaminas. Clasificamos una cepa determinada como auxótrofa si su crecimiento en un medio sin vitaminas se desvió de los cultivos de control suplementados (superposición de diagrama de dispersión en la Fig. 1b y la Fig. 2 complementaria). De este modo, se confirmó que las 22 cepas eran auxótrofas en este experimento (Fig. 1c). Específicamente, cada cepa fue auxotrófica para dos vitaminas en promedio, y el 80 % de las cepas fueron auxotróficas para múltiples vitaminas.

Dentro de las células, las vitaminas se procesan en coenzimas. Las coenzimas son catalíticamente altamente reactivas, pero estables [2]. Debido a que no se consumen en reacciones metabólicas y solo se sintetizan para compensar la dilución por crecimiento, las coenzimas o sus precursores son potencialmente almacenables en las células. Para evaluar el potencial de almacenamiento intracelular de vitaminas en las cepas auxotróficas seleccionadas, utilizamos los datos de crecimiento semicontinuo para calcular el número total de duplicaciones que logró cada cepa después de la privación de vitaminas antes de desviarse del crecimiento exponencial determinado por comparación con cultivos de control suplementados (Fig. 1b; Fig. 2 complementaria). Estos valores pueden servir como indicadores del almacenamiento de vitaminas. Descubrimos que la mayoría de las cepas tenían un almacenamiento de vitaminas que permitía 1 o 2 duplicaciones, que era similar a la de los mutantes de E. coli [2]. Sin embargo, también observamos que algunas cepas auxotróficas mantuvieron un crecimiento exponencial durante un período prolongado después de la eliminación de la biotina, lo que se tradujo en 4 o 5 duplicaciones utilizando las reservas de biotina (16 a 32 veces el exceso de reserva). Una cepa, Chryseobacterium Leaf201, tenía un reservorio que permitía 9 duplicaciones (un exceso de 512 veces) después de la retirada de la vitamina (Fig. 1d). También confirmamos de manera ejemplar para Rhizobium Leaf68 que la detención del crecimiento coincide con el agotamiento intracelular de la coenzima (Fig. 3 complementaria).

Conociendo los requisitos de vitaminas para 22 cepas validadas, a continuación nos dispusimos a identificar la posible base genética de las auxotrofias observadas mediante el análisis de las vías biosintéticas de las vitaminas mediante la anotación de grupos de grupos ortólogos de proteínas (COG). Como controles prototróficos, estudiamos 13 cepas adicionales que confirmamos que crecen en medio mínimo sin suplementos (Fig. 4 complementaria). Primero, preguntamos si podríamos haber predicho la auxotrofia observada solo a partir de datos genómicos. Siguiendo informes previos en los que el porcentaje de genes biosintéticos ausentes de una vía se ha utilizado como marcador de auxotrofia [12,13,14,15,31], estudiamos la fracción de términos COG biosintéticos presentes en las cuatro vías de síntesis de coenzimas. Todas las cepas, incluidos los protótrofos, carecían de muchos pasos biosintéticos en las vías de las cuatro coenzimas estudiadas (biotina, tiamina, coenzima A, NAD), y no observamos sistemáticamente menos pasos en las vías de los auxótrofos (Fig. 2). Luego preguntamos si inferir auxotrofias de la presencia/ausencia de genes individuales daría como resultado una mejor predicción de auxotrofias validadas experimentalmente. Con este fin, comparamos la frecuencia con la que estaba presente cada término COG de una ruta de biosíntesis de vitaminas para el grupo auxotrófico versus prototrófico utilizando una prueba de Chi-cuadrado. De esta manera, identificamos de 1 a 3 genes ausentes suficientes para explicar cada auxotrofia (Tabla 1). Para obtener más detalles sobre la naturaleza de las reacciones específicas, consulte la Nota complementaria 1.

una Fracción de términos COG de cada vía de biosíntesis de coenzimas (filas) presentes en cada cepa (columnas); las cepas están codificadas por colores por filo y agrupadas por porcentaje de vía presente. Los rectángulos negros indican que se encontró que la cepa correspondiente era auxotrófica para la coenzima en este estudio (Fig. 1).

Después de identificar de 1 a 3 genes probablemente responsables de cada auxotrofia observada, investigamos si los hallazgos también se aplicaban a las cepas auxotróficas restantes en la colección de cepas At-LSPHERE (Figura complementaria 1c y Figura 1a). Para lograr esto, queríamos crear clasificadores robustos para cada uno de los cuatro requisitos auxotróficos observados. Primero generamos una muestra de 63 cepas auxotróficas, para 35 de las cuales se validaron anteriormente y 28 cepas adicionales para las cuales se usaron las predicciones de la Fig. 1c complementaria como variable objetivo. En segundo lugar, entrenamos un clasificador de árboles de decisión basado en las 1 a 3 características seleccionadas en el análisis de chi-cuadrado (Tabla 1) o en muchas características seleccionadas al azar. Estos modelos alcanzaron métricas de rendimiento de 80 a 100 % (Figura 5 complementaria). Utilizamos los modelos para predecir la auxotrofia de 139 cepas de la colección At-LSPHERE para las que se observó crecimiento en el medio suplementado (y, por lo tanto, son comparables en fisiología) y para las que estaban disponibles las anotaciones COG (Tabla complementaria 3). También usamos estas características para volver a investigar la auxotrofia a nivel taxonómico. Los términos COG que identificamos como ausentes en el análisis reprodujeron el enriquecimiento filogenético estimado para la auxotrofia en Actinobacteria y Alphaproteobacteria estrechamente relacionadas con Rhizobium spp. (Fig. 6 complementaria; comparar con la Fig. 1 complementaria).

La reducción del genoma se ha descrito previamente en bacterias auxotróficas ambientales [32]. Por lo tanto, abordamos la reducción del genoma y los posibles eventos concomitantes de pérdida de genes para las 139 cepas para las cuales las predicciones de auxotrofia fueron posibles en función de la anotación genómica funcional y el crecimiento observado en un medio definido (Fig. 6 complementaria). De hecho, encontramos genomas significativamente más pequeños en auxótrofos en comparación con los protótrofos (Fig. 3a). No obstante, este efecto dependía de la clase/phylum: la reducción del genoma fue significativa en Actinobacteria (19 % de genomas más pequeños), por lo que una gran fracción (> 50 %) de las cepas son auxótrofas (Fig. 1b complementaria). Como solo hay seis especies de Firmicutes dentro de las cepas analizadas, sacar conclusiones generales es un desafío. Sin embargo, los cuatro auxótrofos exhiben un genoma que tenía solo la mitad del tamaño de las dos cepas prototróficas y también presentan menos marcos de lectura abiertos (Fig. 7 complementaria). Las cepas auxotróficas identificadas aquí requerían en promedio dos aminoácidos y dos vitaminas (Fig. 1, Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, la pérdida observada de genes biosintéticos daría cuenta de genomas 0,25 % más pequeños en auxótrofos (para una bacteria que codifica un promedio de 5000 genes; estimado en función de la Fig. 3a). Por lo tanto, nuestra observación de que los auxotrofos tienen genomas más pequeños provoca la pregunta de si existen otros procesos o vías biológicas asociadas a la auxotrofia que expliquen la reducción del genoma.

Genomas obtenidos de RefSeq con los números de acceso en Source Data 5. En todos los paneles, se incluyeron 139 cepas que crecieron en cultivos líquidos (Figura 1 complementaria) y para las cuales se disponía de anotaciones COG. El estado de la auxotrofia se predijo utilizando los modelos de la figura 2 y la tabla 1. a Tamaños del genoma entre auxótrofos y protótrofos. b Número de reacciones que requieren cada coenzima derivada de vitaminas (eje x) en cepas que son auxotróficas frente a prototróficas para cada coenzima (en gráficos separados). Por ejemplo, el primer gráfico en la parte superior izquierda muestra una comparación del uso de coenzimas de 6 coenzimas entre auxótrofos y protótrofos de biotina. Los modelos metabólicos se obtuvieron mediante la ejecución de CarveMe [33] en los números de acceso de RefSeq. c Vías en las que >20 % de los genes estaban presentes de forma diferencial entre auxótrofos y protótrofos para cada vitamina. Aquí, "infrarrepresentado" se refiere a menos abundante en auxótrofos.

Fuente de datos 5.

Una adaptación genómica concebible que vincularía la auxotrofia con la reducción del genoma es que las cepas auxotróficas han evolucionado para ser menos dependientes de las coenzimas que no pueden sintetizar. Sin embargo, el escenario opuesto también es plausible: si la vitamina está disponible libremente en el medio ambiente, podría haber una presión de selección positiva para preferir las coenzimas de las vitaminas sin costo. Para investigar si existe una correlación (positiva o negativa) entre la auxotrofia de una coenzima dada y el uso de la misma en términos de número de enzimas, creamos modelos metabólicos a escala del genoma para todas las cepas individuales (GEM) [33]. En general, la cantidad de reacciones en los modelos metabólicos fue similar en ambos grupos (Fig. 7 complementaria), lo que indica que los auxótrofos no tienen redes metabólicas optimizadas. Nos propusimos investigar si las cepas auxotróficas utilizan preferentemente una coenzima sobre la otra en sus reacciones enzimáticas; en particular, los auxótrofos de niacina pueden potencialmente usar enzimas dependientes de FAD o FMN en lugar de las dependientes de NAD (P). Usando GEM, calculamos el número de enzimas que requiere cada coenzima tanto para auxótrofos como para protótrofos para medir el grado de dependencia que tiene una cepa de la vitamina correspondiente. Aunque los GEM no incluyen información sobre los niveles de expresión de las enzimas individuales en cuestión (y, por lo tanto, el requisito diferencial potencial de la enzima), sus restricciones estequiométricas y su estructura de red brindan una mayor confianza para la expresión génica que el análisis genómico solo. Encontramos que para la mayoría de las coenzimas, los auxótrofos y los protótrofos tenían el mismo número de reacciones (Fig. 3b). Los auxótrofos de niacina tenían un 10 % más de enzimas con NAD(H) y un 20 % menos de enzimas con FAD(H) (valor de p <0,05, prueba de χ2), lo que indica una preferencia por utilizar la coenzima cuya biosíntesis se pierde. Para biotina, las cepas auxotróficas tenían un 15 % más de enzimas dependientes de biotina (valor p <0,05, prueba de χ2). En general, este análisis muestra que la reducción del genoma observada en las cepas auxotróficas no puede explicarse sistemáticamente por un menor número de enzimas que requieren la coenzima respectiva. Como tal, es posible que la capacidad metabólica no se reduzca en los auxótrofos, y los auxótrofos pueden haber asignado sus reacciones metabólicas al uso de las vitaminas esenciales.

Además del impacto directo en el uso de coenzimas, razonamos que las cepas auxotróficas podrían haber desarrollado otras características indirectamente relacionadas con el uso de coenzimas, ya sea antes o después de convertirse en auxotrofas. Dichos rasgos podrían implicar eventos de pérdida de función en otras vías de biosíntesis, así como la pérdida de genes que no son esenciales en el nicho confinado, como la utilización de una fuente de carbono. Por lo tanto, buscamos abordar la reasignación metabólica de manera más general. Para encontrar genes cuya presencia se correlacione con la auxotrofia, realizamos un análisis de genómica funcional de todo el genoma. Primero evaluamos si cada término COG era diferencialmente abundante entre auxótrofos y protótrofos, luego mapeamos los términos COG significativamente diferentes a las vías. La significación se determinó mediante la prueba de χ2 y la corrección de pruebas múltiples se realizó con FDR. De esta manera, identificamos un conjunto de diferencias conservadas entre auxótrofos y protótrofos (Fig. 3c, Tabla complementaria 4). En general, el patrón estuvo dominado por la pérdida de función en los auxótrofos. Al establecer el límite de los términos COG diferencialmente abundantes en el 20 % de todos los genes de la ruta, recuperamos la ruta biosintética para cada auxotrofia conocida, lo que confirmó que este enfoque puede capturar diferencias biológicamente significativas entre los grupos. Otras ausencias de genes implicaron la pérdida de la función enzimática en la energía, especialmente el metabolismo de la glucosa, así como otras vías biosintéticas como los aminoácidos y otras coenzimas más allá de las probadas aquí, mientras que los sistemas de rescate fueron más frecuentes en el grupo auxotrófico.

Los experimentos de cocultivo se pueden utilizar para proporcionar información sobre las interacciones bacterianas en las comunidades microbianas [34,35,36,37]. Aquí, preguntamos si los auxótrofos acceden a las vitaminas de los protótrofos cocultivados. Con este fin, seleccionamos cepas de vitaminas auxotróficas (n = 10) y prototróficas (n = 10) filogenéticamente representativas para un experimento de cocultivo (Fig. 4a). Realizamos un experimento de dilución en serie de la mezcla de cepas (3 réplicas biológicas cada una en 3 réplicas técnicas) en medio mínimo suplementado con glucosa 20 mM y los 20 aminoácidos proteinogénicos (100 μM cada uno). Los medios solo diferían en si se suplementaban con vitaminas. (Fig. 4b, c). Los cultivos se analizaron a intervalos regulares mediante secuenciación del gen 16S rRNA para determinar la composición relativa de las especies bacterianas. El crecimiento en ambas condiciones fue comparable (Fig. 4c). Observamos que el perfil de abundancia relativa entre los medios fue similar en ambos grupos, es decir, auxótrofos y protótrofos, e independientemente de si las vitaminas se complementaron o no (Fig. 4d, columnas grises frente a naranja para cada cepa; Fig. 8 complementaria). La única especie auxotrófica que se benefició de las vitaminas suplementadas fue Pedobacter Leaf132 (valor p 0,003, rm-ANOVA). Dos cepas auxotróficas, Rhizobium Leaf202 y Arthrobacter Leaf137, tenían abundancias relativas más altas en cultivos donde no se suplementaron vitaminas (valores de p <0,01 rm-ANOVA). Por lo tanto, este análisis muestra que la falta de suplementos vitamínicos externos no previene el crecimiento de auxótrofos cuando se cultiva en una comunidad con cepas prototróficas y sugiere una alimentación cruzada de vitaminas.

a Selección de cepas para cocultivos. Se eligieron un total de 20 cepas para representar la diversidad filogenética en la microbiota foliar de A. thaliana. La agrupación se basa en secuencias del gen 16S rRNA de longitud completa. b Las cepas que se muestran en el panel A se mezclaron juntas en números iguales (ver Métodos para más detalles) en tres inóculos biológicos. Con cada inóculo se inocularon tres repeticiones técnicas bajo dos regímenes de crecimiento: medio mínimo con y sin vitaminas, resultando 18 cultivos. Se añadieron los 20 aminoácidos proteinogénicos a todos los cultivos (100 µM). c Medidas de crecimiento de los cultivos de b Los cultivos se cultivaron durante un total de 120 h y se diluyeron a las 24, 48 y 72 h. A las 9, 24, 48, 72, 96 y 120 h (indicadas como puntos), se tomaron muestras para la secuenciación del gen 16S rRNA (células) y LC/MS (sobrenadantes). d Abundancia relativa de las 20 cepas (columnas) en el experimento de cocultivo. Para cada cepa, el promedio de las tres réplicas técnicas para cada réplica biológica se muestra como el cambio de abundancia relativa en comparación con el punto de tiempo anterior, primero en medio mínimo con vitaminas (columnas etiquetadas con cuadros naranjas), luego en medio mínimo sin vitaminas. (columnas etiquetadas con gris). Para cada cepa, las tres réplicas en la misma condición están separadas por líneas blancas finas y las dos condiciones están separadas por líneas grises gruesas. Las 20 cepas están separadas por gruesas líneas negras. Las cepas se agrupan por filogenia calculada a partir de la alineación del gen 16S rRNA.

Para evaluar la presencia de alimentación cruzada, examinamos los medios gastados de los cocultivos mencionados anteriormente (Fig. 5). Medimos los medios sin bacterias (punto de tiempo de 0 h), así como los sobrenadantes después de 9 h y 24 h de cocultivo. Primero comparamos las reservas de vitaminas en las dos condiciones (± vitaminas). Cuando se complementaron las vitaminas, la concentración de niacina, pantotenato y tiamina disminuyó entre las 0 h y las 9 h, y aún más entre las 9 h y las 24 h, lo que sugiere una absorción neta por parte de las bacterias cultivadas en el medio (serie naranja en la Fig. 5a). Se esperaba una disminución en las reservas de estas cuatro vitaminas considerando que la mitad de las cepas inoculadas eran auxotróficas para una o más de ellas. Sin embargo, la concentración de biotina no disminuyó durante el experimento (serie naranja en el primer panel de la Fig. 5a) a pesar de que casi todas las cepas eran auxotróficas, lo que indica que las tasas de absorción de biotina por parte de los auxótrofos son pequeñas o que las cepas prototróficas secretan biotina en tasas comparables a la absorción de biotina por cepas auxotróficas. También observamos la captación de piridoxal, para el cual ninguna cepa fue auxotrófica. La concentración de riboflavina estuvo por debajo del límite de detección en los medios libres de bacterias, pero se acumuló constantemente en el medio durante el crecimiento bacteriano, lo que sugiere que al menos una de las cepas del cocultivo secretaba más riboflavina que otras. En el medio sin vitaminas, encontramos una acumulación de niacina, pantotenato y piridoxal a las 9 h, seguida de una disminución de estas vitaminas a las 24 h, lo que implica que las bacterias secretaron primero estas vitaminas en el medio y luego las absorbieron ( Fig. 5a, serie gris). Las reservas de tiamina y biotina permanecieron por debajo del límite de detección. Los aminoácidos que se complementaron en ambos medios (junto con la glucosa como única fuente principal de carbono) disminuyeron en todos los cocultivos en comparación con los medios puros, lo que indica una absorción neta del medio (Fig. 5b). La mayoría del glutamato proporcionado (una fuente atractiva de carbono y nitrógeno [38]) todavía estaba disponible después de 9 h de cocultivo y se consumía principalmente durante la fase estacionaria.

a Serie temporal de consumo de vitaminas en cocultivos medido a partir de sobrenadantes de cocultivos. Para cada vitamina, el log10 del área máxima normalizada de la corriente de iones totales se muestra primero en cultivos suplementados con vitaminas y luego en cultivos sin vitaminas. b Aminoácidos medidos a partir de los sobrenadantes de cocultivo. Los datos son áreas de pico transformadas log10 normalizadas a la señal del medio que se complementó con aminoácidos en ambos medios (+ y -vitaminas). Cada celda del mapa de calor representa el promedio de 9 repeticiones.

Los mutantes auxotróficos a menudo tienen una ventaja de aptitud sobre las cepas ancestrales prototróficas en experimentos de competencia por parejas [13, 24, 39]. En el siguiente análisis, evaluamos si esto también es cierto en un contexto comunitario de auxótrofos y protótrofos naturales. Específicamente, predijimos la riqueza de especies a partir de la tasa de crecimiento y el rendimiento de cada cepa en cultivos individuales y comparamos estas predicciones con los datos obtenidos experimentalmente (Fig. 4). Realizamos el análisis de los datos de abundancia relativa en medio mínimo suplementado con vitaminas (columnas naranjas en la Fig. 4d) comparando la riqueza de especies (número de especies detectadas dividido por el número de especies introducidas originalmente en el cocultivo) a lo largo del tiempo en el dos grupos: auxótrofos y protótrofos. Descubrimos que dos tercios de las cepas no se detectaron y, por lo tanto, se interpretaron como perdidas después de los dos primeros ciclos de dilución (después de 24 h y 48 h) antes de estabilizarse finalmente a las 72 h (Fig. 6a). Se perdieron más cepas en el grupo prototrófico: tres cuartas partes de los prototrofos no se detectaron después de 48 h, significativamente menos que los auxótrofos, por lo que solo la mitad no se detectó (p ≪ 0.001, rm-ANOVA, Fig. 6a). Para investigar si era de esperar el resultado estadísticamente diferente entre auxótrofos y protótrofos, intentamos predecir la riqueza de especies en función del crecimiento en monocultivos. Con este fin, los parámetros de crecimiento se determinaron experimentalmente en el mismo medio suplementado con vitaminas utilizado para los experimentos de cocultivo (Fig. 6b). Utilizando estos datos, parametrizamos un modelo de recursos de consumidores y simulamos la abundancia esperada de cada cepa en los cocultivos suplementados con vitaminas. Brevemente, la concentración de glucosa se actualizó iterativamente para simular una posible limitación de carbono en un cultivo por lotes, las tasas de crecimiento se actualizaron de acuerdo con la cinética de Monod y no se incluyó interacción entre especies (consulte Métodos para obtener detalles del modelo). A partir de las abundancias simuladas, calculamos la riqueza de especies teórica. Descubrimos que en el grupo prototrófico, la simulación capturó cualitativamente la riqueza de especies observada experimentalmente (línea azul claro en comparación con la línea azul oscuro en la Fig. 6c) y predijo correctamente la riqueza de especies final. Todas las especies auxotróficas se perdieron en la simulación (línea roja clara en comparación con la línea roja oscura en la Fig. 6c), como se esperaba debido a sus tasas de crecimiento y rendimientos más bajos en comparación con las cepas prototróficas (Fig. 6b).

a Riqueza de especies en cocultivos cultivados en medio suplementado con vitaminas. Datos de origen en Datos de origen 6. b Tasas de crecimiento y rendimientos determinados experimentalmente (= capacidad de carga) para cada cepa que crece en el medio suplementado con vitaminas. Fuente de datos para tasas de crecimiento en Fuente de datos 9 y para rendimientos en Fuente de datos 10. c–f Riqueza de especies modelada por modelos de consumo-recurso. Las barras de error para los modelos se obtuvieron mediante análisis de sensibilidad de la siguiente manera. En c y d, el umbral para que una bacteria cuente como "presente" varió del 0,1% al 1% de la abundancia total. En e, el umbral en la tasa de crecimiento de las bacterias que se establecieron para secretar la segunda fuente de carbono varió entre 0,3 h−1 (n = 15) y 0,6 h−1 (n = 3). En f, la eficacia de los auxótrofos para usar preferentemente la segunda fuente de carbono varió de 2 a 5 veces la de los protótrofos. Datos de origen en Datos de origen 6.

Datos de origen 6Datos de origen 9Datos de origen 10.

La aparente contradicción entre el modelo de recursos del consumidor y los datos experimentales nos llevó a explorar si una extensión de los modelos podría capturar la riqueza de especies observada. Comenzamos implementando un término de alimentación cruzada de vitaminas, que no estaba incluido en el modelo inicial. A partir de las mediciones exometabolómicas (Fig. 5), aprendimos que los protótrofos secretan vitaminas en el medio, lo que aumenta al menos transitoriamente su concentración de vitaminas. Además, la secuenciación del gen 16S rRNA de muestras derivadas de cultivos a los que no se añadieron vitaminas indicó que el aumento observado en la concentración de vitaminas durante el cocultivo con protótrofos fue suficiente para apoyar el crecimiento de los auxótrofos (Fig. 4). Si la concentración de vitaminas en el medio de crecimiento se volvió lo suficientemente baja como para limitar el crecimiento antes de la limitación de carbono, estas vitaminas adicionales podrían haber resultado en un aumento en el rendimiento. Con este fin, adquirimos datos de crecimiento en un rango de concentraciones de vitaminas fisiológicamente relevantes (Fig. 9 complementaria). Las diferencias observadas tanto en la tasa de crecimiento como en el rendimiento fueron generalmente pequeñas. No obstante, modificamos el crecimiento de cada cepa en el modelo de recursos del consumidor de los parámetros de crecimiento de cada cepa con 1 µM de vitaminas a aquellos cuando se cultivan con 10 µM de vitaminas, lo que reduce la posible detención temprana del crecimiento. Observamos que este aumento simulado en la concentración de vitaminas no resultó en un aumento de la riqueza de especies auxotróficas prevista (Fig. 6d).

Los modelos de recursos del consumidor con alimentación cruzada de vitaminas no capturaron la diferencia observada experimentalmente en la riqueza de especies (Fig. 6d). Un escenario alternativo para la alta riqueza en el grupo auxotrófico del cocultivo es que pueden utilizar subproductos metabólicos como fuentes de carbono. Se sabe que incluso en condiciones aeróbicas, muchas bacterias de rápido crecimiento fermentan su fuente de carbono, lo que resulta en la secreción de subproductos como piruvato, acetato o succinato [40, 41]. Por lo tanto, los cambios en la composición de la comunidad durante la fase estacionaria (entre 9 h y 24 h, así como entre 96 h y 120 h) probablemente se deban al (co) consumo de subproductos metabólicos después de que se consume la principal fuente de carbono, la glucosa. Para abordar este escenario, introdujimos una segunda fuente de carbono, imitando efectivamente la secreción de un compuesto como el acetato por cepas prototróficas de rápido crecimiento (Fig. 6b) en el modelo. Luego permitimos que todas las cepas de crecimiento lento crecieran en este nuevo recurso disponible a tasas proporcionales a su tasa de crecimiento en glucosa. A medida que los auxótrofos se enriquecieron en el grupo de crecimiento lento, pudieron usar preferentemente el subproducto, mientras que le dieron al grupo prototrófico la misma oportunidad de crecer en el sustrato secretado dado que se cumplió la condición límite de crecimiento lento (ver Figura complementaria 10 para obtener detalles sobre la concentración y el efecto sobre el número total de células). Agregar el término de alimentación cruzada de carbono de hecho mejoró las predicciones en comparación con el modelo original; ambos grupos pierden riqueza de especies, pero ninguno de los grupos se pierde por completo, y la riqueza de especies se estabiliza finalmente (Fig. 6e). Este modelo, sin embargo, todavía predice que el grupo prototrófico tendrá una mayor riqueza final de especies. Por lo tanto, le dimos a los auxótrofos acceso preferencial a la nueva fuente de carbono disponible al aumentar su afinidad por el sustrato. En este escenario, los modelos capturaron la dinámica cualitativa determinada experimentalmente (Fig. 6f). En conjunto, este análisis sugiere que una mayor capacidad para la alimentación cruzada de fuentes de carbono determina el éxito de las cepas auxotróficas en cocultivos.

Las coenzimas no solo son ubicuas, sino que generalmente se conservan en todos los dominios de la vida. Expanden la caja de herramientas catalítica de las proteínas y actúan como moléculas portadoras de ácidos orgánicos y unidades de un carbono [1]. Aquí, caracterizamos los requisitos auxotróficos de las bacterias ambientales aisladas de la filosfera de A. thaliana y exploramos los rasgos genómicos y fisiológicos que coexisten con la incapacidad de sintetizar vitaminas. Encontramos que la auxotrofia de vitaminas era común para la biotina, la niacina, el pantotenato y la tiamina y que la auxotrofia se asociaba sistemáticamente con la ausencia de genes específicos en las respectivas vías biosintéticas. Aunque otros estudios informaron la ausencia de algunos de los genes identificados en este estudio en otros auxótrofos [7, 8], se requerirán más estudios para evaluar si la auxotrofia generalmente es causada por la pérdida de estos pocos genes específicos. Además, nuestros análisis experimentales y bioinformáticos definieron un conjunto de funciones específicas de auxótrofos, así como la alimentación cruzada y el almacenamiento de coenzimas en diversos aislados bacterianos auxótrofos naturales.

Después de que una cepa pierde una ruta biosintética, se vuelve dependiente de una fuente externa de ese nutriente. Por lo tanto, su nicho estará limitado a aquellos con acceso al menos ocasional a este recurso. Por lo tanto, las poblaciones de cepas pueden perder la capacidad de sintetizar todos los compuestos que puede suministrar el nicho forzado. De hecho, observamos múltiples auxotrofias en cuatro de cinco auxótrofos confirmados (Fig. 1). Anteriormente se demostró que la alimentación cruzada de nutrientes promueve la coexistencia [42]. En un sistema de dos cepas, una cepa "beneficiaria" (mutante de pérdida de síntesis) no superó a la cepa "auxiliar" que suministró el nutriente. Si estaba involucrada una tercera cepa que suministra el mismo nutriente, el beneficiario superó a la cepa auxiliar; por lo tanto, un metabolito intercambiado solo puede estabilizar una comunidad que consta de dos cepas. Las comunidades que se encuentran en la naturaleza pueden tener cientos o miles de miembros. Por lo tanto, se requieren múltiples auxotrofias por cada cepa auxotrófica para las interacciones de alimentación cruzada para estabilizar grandes comunidades. Como observamos múltiples auxotrofias en el 80% de los auxótrofos, pueden contribuir a la estabilidad observada de la comunidad [30, 43] mediante alimentación cruzada. Por lo tanto, sugerimos que la identidad del compuesto requerido está dictada por el nicho, pero el número de auxotrofias por cepa es más bien una propiedad inherente de la comunidad. Aunque en gran parte oligotrófica, hay cantidades detectables de fuentes de carbono (glucosa, metanol, sacarosa, fructosa) [44], aminoácidos e incluso vitaminas en la superficie de las hojas, disponibles ya sea por la propia planta huésped o por las bacterias que habitan el nicho [6 , 45, 46]. No se observaron auxotrofias para la vitamina B12 metabólicamente costosa (que no se usa en el metabolismo de las plantas) (Fig. 11 complementaria).

Los genomas de las poblaciones bacterianas cambian en respuesta a la presión de selección establecida por su entorno y como efectos aleatorios, por ejemplo, la deriva genética. Por ejemplo, la biosíntesis de diversos compuestos requiere la asignación de recursos celulares en términos de energía (principalmente ATP y coenzimas redox) y síntesis de proteínas, es decir, un costo. Siempre que el producto de dicho proceso biosintético esté disponible en el medio ambiente, aquellos organismos que pierden la capacidad biosintética de ese compuesto evitan el costo. En una serie de estudios, se argumentó que al evitar el costo de la biosíntesis, las células obtienen una ventaja de aptitud física, lo que permite una ventaja selectiva de la pérdida de biosíntesis; esta teoría se denomina Hipótesis de la Reina Negra [4, 13, 39]. Sin embargo, la pérdida de biosíntesis también puede ser neutral y estar causada por la deriva genética. Los genomas más pequeños a menudo se observan en bacterias aisladas de entornos ricos en crecimiento y están fuertemente relacionados con estilos de vida endosimbióticos y parasitarios [32, 47,48,49]. Sin embargo, no es posible inferir el mecanismo entre la selección y la deriva genética en base a la reducción del genoma observada.

La reducción del genoma puede ocurrir de dos maneras: 1. reducción general del genoma y 2. pérdida de genes específicos [42]. En este estudio, observamos la ausencia específica y general de genes. Sin embargo, la mayor parte de la reducción del genoma cayó en la primera categoría, ya que observamos hasta un 19 % de genomas más pequeños en los auxotrofos, menos del 1 % de los cuales puede explicarse por la falta de genes directamente relacionados con la auxotrofia (Figs. 2 y 3). . También observamos la reasignación genómica y metabólica, especialmente en los auxótrofos de niacina (Fig. 3b, c). Nuestros análisis también indican que las bacterias auxotróficas tienen más enzimas que requieren la vitamina para la que son auxotróficas (especialmente biotina y NAD) que los protótrofos (Fig. 3b). Esta observación no implica una mayor rotación o necesidad de la coenzima, sino cuántas reacciones podrían verse perturbadas por la limitación de la vitamina y, por lo tanto, el impacto que tendría la limitación de la vitamina en la red metabólica. El hecho de que el requisito en sí permanezca constante o incluso disminuya depende de la medida en que se traduzcan los genes. Presumimos que el grado de dependencia (definido aquí por la cantidad de enzimas que usan la coenzima) podría no afectar tanto a los auxótrofos como a los protótrofos porque los protótrofos podrían minimizar su dependencia de la coenzima debido al costo de la biosíntesis de la vitamina.

La proporción de genes biosintéticos presentes en una vía se usa a menudo para clasificar las bacterias en auxótrofas o protótrofas [10, 13, 16]. Nuestros resultados están en línea con trabajos publicados anteriormente [18], lo que sugiere que predecir la auxotrofia en función de la frecuencia de los genes da como resultado predicciones inexactas. También observamos que, aunque se observan con frecuencia brechas aleatorias en los genomas en general y en las vías biosintéticas de coenzimas en particular, la falta de 1-3 genes específicos de biosíntesis de coenzimas por vía está fuertemente asociada con la auxotrofia observada (Fig. 2; Tabla 1). La pérdida de algunos de los genes que identificamos aquí ya se ha asociado con auxotrofia antes [7, 8]. Sigue siendo una pregunta abierta si la auxotrofia es causada universalmente por la pérdida de unos pocos genes específicos. La precisión de la predicción de las auxotrofias basadas en datos genómicos podría mejorarse, por ejemplo, dando un mayor peso a los genes que se sabe que comúnmente se pierden en los auxótrofos. En este estudio, pudimos predecir la auxotrofia con un 80-100 % de exactitud, recuperación y precisión al entrenar modelos con las características seleccionadas (Tabla 1).

Observamos una mayor robustez a la limitación de biotina en algunas cepas auxotróficas (Fig. 1), lo que plantea la cuestión del mecanismo de almacenamiento. En los mamíferos, el almacenamiento de biotina se ha relacionado con la acetil-CoA carboxilasa mitocondrial [50]. En levaduras auxotróficas con biotina, se ha sugerido que la biotinilación de histonas sirve como almacenamiento potencial de biotina en Candida albicans auxotrófica, lo que contrasta con la levadura prototrófica con biotina Saccharomyces cerevisiae que no biotinila sus histonas [51]. En su forma más simple, el almacenamiento podría ser inespecífico y estar distribuido entre proteínas que se unen covalentemente a la biotina como grupo protésico. Esta hipótesis está respaldada por la observación de que los auxótrofos de biotina tienen más enzimas que requieren biotina en sus redes metabólicas (Fig. 3b). Queda por probar si un número elevado de enzimas dependientes de biotina es una estrategia de almacenamiento en bacterias, pero está respaldado por un estudio reciente que mostró que la rhizavidina de unión a biotina sirve en el almacenamiento de biotina para Rhizobium spp [52].

La auxotrofia surge con frecuencia en la evolución y, en este estudio, identificamos auxótrofos en todos los filos principales dentro de la microbiota foliar de A. thaliana. Además, en este estudio (Figs. 4–6, Fig. 8 complementaria), observamos, de acuerdo con otros estudios, que los auxótrofos persisten incluso en cocultivos libres de vitaminas con protótrofos [12, 14, 16]. Estas observaciones invocan la pregunta de si los auxótrofos tienen un papel designado en el ensamblaje de la comunidad microbiana. La disimilitud metabólica, al menos teóricamente y en el caso de algunos aminoácidos, puede impulsar la alimentación cruzada [26]. Nuestros resultados respaldan esta idea ya que encontramos que los auxótrofos y los protótrofos son metabólica y filogenéticamente diferentes entre sí. En este estudio comprobamos que los auxótrofos mantienen bien su población en ausencia de vitaminas dado que se cultivan junto con cepas prototróficas que les aportan vitaminas. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los auxótrofos permanecen detenidos en el crecimiento hasta que se secretan suficientes vitaminas para reanudar el crecimiento, y que este estilo de vida cambia la presión de selección hacia un consumo eficiente de subproductos metabólicos liberados por otras cepas.

Descubrimos que las cepas auxotróficas tuvieron más éxito en cocultivos suplementados con vitaminas de lo esperado a partir de su crecimiento en cultivos individuales. Un modelo de recurso-consumidor parametrizado por la tasa de crecimiento obtenida experimentalmente y datos de rendimiento con un término de alimentación cruzada de carbono capturó suficientemente esta observación. Dado que el crecimiento de las cepas auxótrofas no puede reanudarse hasta que los protótrofos hayan secretado suficientes vitaminas, el uso preferencial de una fuente de carbono secretada junto con la vitamina podría dar a los auxótrofos una ventaja competitiva. Nuestros hallazgos e inferencias son congruentes con resultados anteriores en los que la coexistencia estable se explicaba mediante la implementación de un término de alimentación cruzada de carbono no específico en el marco de un modelo de recursos del consumidor, y ese crecimiento de dichos subproductos metabólicos a menudo es comparable al crecimiento del carbono primario. fuente como la glucosa [35]. Nuestro marco sugiere que dicha facilitación metabólica no solo promueve la coexistencia, sino que el consumo preferencial de subproductos del carbono también puede representar una estrategia viable para evitar la exclusión competitiva. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la auxotrofia es parte de un estilo de vida que se especializa en el consumo de productos metabólicos de otras bacterias y, por lo tanto, puede ser beneficiosa para las bacterias de vida libre que forman parte de una comunidad microbiana.

Todas las cepas de At-LSPHERE utilizadas en este estudio se publicaron previamente [30]. Todos los ensayos de crecimiento se realizaron a 28 °C para las cepas At-LSPHERE ya 37 °C para las cepas de E. coli [53]. La turbidez de los cultivos en matraz de agitación se determinó midiendo la densidad óptica a 595 nm ("OD600") en cubetas semimicro (Bio-Greiner) usando un Biophotometer Plus (Eppendorf). Las muestras se diluyeron según correspondiera para mantener las lecturas de DO en el rango lineal. Para cultivos por lotes con monitorización continua de la DO para placas de 96 pocillos (fondo plano TPP), se utilizó Tecan Infinite M200 Pro con agitación orbital de 1 mm de amplitud.

La base del medio fue un tampón fosfato (2,4 g/l K2HPO4, 2,08 g/l NaH2PO4·2H2O) con sales minerales (1,62 g/l NH4Cl, 0,2 g/l MgSO4·7H2O). Se añadió glucosa a 20 mM y piruvato a 40 mM. Para todos los componentes de los medios, se prepararon stocks 10x, se disolvieron en ddH2O y se esterilizaron por filtración. Las vitaminas se suplementaron cuando se indicó en las siguientes concentraciones: sal hemicálcica del ácido D-pantoténico 1,05 µM, biotina 0,41 µM, riboflavina 1,06 µM, tiamina · HCl 1,19 µM, piridoxal · HCl 0,98 µM, ácido p-aminobenzoico 1,09 µM, cobalamina 0,14 µM, ácido lipoico 0,24 µM, niacina 1,22 µM, ácido fólico 0,23 µM. Los 20 L-aminoácidos proteinogénicos se suplementaron a 0,1 mM cada uno, excepto que el L-triptófano y la L-tirosina se suplementaron a 0,05 mM. Se prepararon stocks de 1000x para todas las demás vitaminas y aminoácidos, excepto para riboflavina y triptófano, para los que se prepararon stocks de 100x.

La regresión lineal de los datos transformados en ln se llevó a cabo utilizando la función linear_regression de sklearn. Se omitieron los puntos de datos que se encontraban fuera de la escala logarítmica lineal. Las tasas de crecimiento solo se calcularon para cultivos que realizaron al menos 2 duplicaciones en fase exponencial.

En los experimentos de agotamiento (consulte la Fig. 1 y la Fig. 2 complementaria), se definió que el crecimiento de las células cultivadas en medios sin vitaminas se desviaba del control suplementado si se cumplían los siguientes criterios. Tenía que haber al menos una diferencia de duplicación de 0,25 en el número total de duplicaciones en los cultivos sin vitaminas y con suplementos de vitaminas. Además, en al menos dos de las tres réplicas, la tasa de crecimiento después de la separación de duplicación de 0,25 tuvo que reducirse en un 25 %; en la réplica restante, se consideró aceptable una reducción del 10%. El almacenamiento se definió como el número de duplicaciones realizadas por una cepa sin la vitamina en este momento. El medio R2A sólido se obtuvo de Sigma.

Para examinar las 224 bacterias de la colección At-LSPHERE [30] en busca de crecimiento en 4 medios (+vitaminas y aminoácidos, −suplementos, +aminoácidos y +vitaminas), cada cepa se inoculó en R2A líquido a partir de un R2A sólido. placa y dejar crecer hasta fase estacionaria (24 h). Luego, se inocularon 10 µl de precultivo en fase estacionaria en 190 µl de cada uno de los 4 medios para un precultivo durante la noche a 28 °C en un agitador de 220 rpm en tres réplicas biológicas. Los cultivos principales se inocularon de la misma manera y las medidas de DO se tomaron en dos momentos: t = 0 y t = 24 h. La OD se normalizó a la OD en pocillos de control (sin células, rellenos con medio). Para la selección de abandono con 50 cepas, se repitió el mismo protocolo con algunos cambios. Aquí, se inocularon 5 µl de precultivo en fase estacionaria en R2A en 45 µl de cada uno de los 4 medios (+vitaminas y aminoácidos, −suplementos, +vitaminas, +aminoácidos) y cada uno de los 30 medios de abandono (cada compuesto individual en los Datos de origen 1) para el precultivo durante la noche y nuevamente para el cultivo principal. Cada 24 h, se transfirieron 5 µl de cultivo en fase estacionaria a placas R2A sólidas y se compararon el color y la morfología de las colonias con las características conocidas de cada cepa para excluir contaminaciones.

Cada cepa se inoculó a partir de placas R2A sólidas en una placa de 96 pocillos en triplicados biológicos y cinco réplicas técnicas en un medio suplementado con 20 aminoácidos y 4 vitaminas: tiamina, niacina, biotina y pantotenato en un volumen de cultivo de 200 µl. Los cultivos principales se prepararon al día siguiente diluyendo 10 µl de cada cultivo celular en medio fresco. Después de un cultivo durante la noche, se alcanzó la etapa exponencial tardía. Las cinco réplicas técnicas se agruparon en un tubo Eppendorf estéril de 2 ml y se lavaron dos veces centrifugando el tubo de suspensión celular (10 000 rpm, 2 min), eliminando el sobrenadante y disolviendo el sedimento celular en 1,5 ml de MgCl2 estéril. Después del segundo lavado, las células se recogieron mediante un paso de centrifugación como antes y los sedimentos resultantes se disolvieron en 50 µl de MgCl2. Se inocularon 5 µl de la suspensión celular resultante en 195 µl de cinco medios que contenían los 20 aminoácidos y diferían en los suplementos vitamínicos. Uno de los medios era un medio de control e incluía las cuatro vitaminas como medio de precultivo. Los otros cuatro medios carecían de una de las siguientes vitaminas: tiamina, biotina, niacina o pantotenato. A continuación, se controló el crecimiento en un lector de placas Tecan (para más detalles, consulte "Ensayos de crecimiento"). Después de cada 2 duplicaciones, los cultivos se diluyeron según correspondiera para mantener el crecimiento exponencial en el rango lineal del lector de placas.

Rhizobium Leaf68 se cultivó en 20 ml de cultivo en un medio que contenía 20 aminoácidos y biotina, niacina y pantotenato. En la fase exponencial tardía (OD~1), las células se recogieron mediante centrifugación (10 000 rpm, 2 minutos), seguido de dos rondas de lavado y sedimentación con 20 ml de MgCl2 estéril y 10 000 rpm durante 2 min. Posteriormente, las células se recolectaron mediante centrifugación y se disolvieron en 1 ml de MgCl2. Los cultivos se inocularon en cuatro cultivos en matraces de agitación con 100 µl de este inóculo: uno de los cultivos se complementó con las 3 vitaminas y un medio de abandono para cada vitamina, respectivamente. La DO se controló una vez por duplicación, y el metaboloma intracelular se muestreó de la siguiente manera. Los cultivos se mantuvieron a 28 °C en un baño de agua con agitación y el volumen de la muestra se determinó en función de la DO (1/OD ml). El volumen determinado de suspensión de células se pipeteó sobre un filtro colocado sobre un matraz de succión para eliminar el medio. Las células que estaban sobre el filtro se lavaron con 10 ml de dH2O que se mantuvo a 28 °C en un baño de agua, y el filtro lavado se transfirió posteriormente a un matraz Schott que contenía 8 ml de solución de extinción acidificada fría (-20 °C) (3 partes MeCN:1 parte de MeOH:1 parte de ácido fórmico 0,05 M). Después de 10 minutos, la solución de extinción se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml y se liofilizó a -50 °C durante la noche. El polvo resultante se disolvió en 250 µl de dH2O preenfriada y se mantuvo a -80 °C hasta su análisis.

La separación por CL se logró con un sistema UHPLC Thermo Ultimate 3000 (Thermo Scientific) a un caudal de 500 µl min–1. Se aplicaron dos métodos de separación diferentes. La primera separación se logró mediante interacción hidrófila (HILIC; columna Aquity UHPLC BEH Amide [100 × 2,1 mm, tamaños de partículas de 1,7 µm; Waters]) como se describe en [54]. Para el análisis HILIC, se secaron 50 µl de la muestra acuosa (SpeedVac) y se disolvieron en MeCN. La separación de fase inversa C18 (C18RP) se logró utilizando una columna Kinetex XB-C18 (tamaño de partícula 1,7 µm, tamaño de poro 100 Å; dimensiones 50 × 2,1 mm2, Phenomenex) como se describe en otro lugar [55]. Para el análisis de masas, el instrumento LC se acopló a un instrumento Thermo QExactive plus (Thermo Fisher Scientific), y el espectrómetro de masas se operó en modo FTMS positivo y negativo con una resolución de masa de 30 000 (m/z = 400). Se utilizó una sonda de ionización por electropulverización (ESI) calentada aplicando los siguientes parámetros de fuente: vaporizador 350 °C; gas auxiliar 5; voltaje de pulverización de iones +3,5 kV, gas envolvente, 50; gas de barrido, 0; nivel de radiofrecuencia, 50,0; temperatura capilar, 275 °C. Para analizar los datos, se realizó una extracción dirigida de cromatogramas iónicos utilizando emzed2 [56]. Las ventanas de tiempo de retención se determinaron en base a estándares químicos y las ventanas seleccionadas se normalizaron a la señal de fondo.

Como preexperimento, se determinaron los recuentos de UFC por unidad de OD utilizando un método de placas de dilución. Las colonias se contaron a partir de una dilución que permitió la determinación a partir de puntos de 5 µl (Tabla complementaria 5). A continuación, las 20 cepas se inocularon a partir de placas R2A sólidas en un medio líquido que contenía 20 aminoácidos y 10 vitaminas y se cultivaron durante la noche en triplicados biológicos en un volumen de cultivo de 10 ml. Después del precultivo, todas las cepas se encontraban en fase estacionaria. Se midió la DO de cada cultivo y se ajustó a 5e8 células por ml. Estos cultivos ajustados luego se combinaron en un inóculo donde cada cepa tenía una abundancia de aproximadamente 1/20. El inóculo se lavó como se describe en la sección "Preparación de muestras para análisis LC/MS de experimentos de agotamiento". Se tomaron cinco muestras de secuenciación de cada inóculo, y de cada inóculo se inocularon tres réplicas técnicas tanto en medios suplementados con vitaminas como libres de vitaminas. Los volúmenes de cultivo fueron de 20 ml y los cultivos se dejaron crecer a 28 °C con agitación orbital de 200 rpm. A las 9, 24, 48, 72, 96 y 120 h, se tomaron muestras para la secuenciación del gen 16S rRNA y la exometabolómica de la siguiente manera. Para la secuenciación del gen 16S rRNA, se transfirió una muestra de 1 ml a un tubo de extracción de ADN del FastDNA SPIN Kit for Soil. Los tubos se centrifugaron (10.000 rpm, 5 minutos, 4 °C), se retiraron los sobrenadantes y los tubos con sedimentos celulares se congelaron y mantuvieron a -80 °C hasta la extracción. Para la exometabolómica, se transfirió 1 ml de cultivo a un tubo Eppendorf de 2 ml y se centrifugó (10 000 rpm, 5 min, 4 °C). Se almacenaron 200 µl de sobrenadantes en dos réplicas técnicas en una placa de 96 pocillos y se almacenaron a -20 °C hasta el análisis (consulte "Análisis de LC/MS" para obtener más detalles).

El ADN se extrajo utilizando el FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se transfirieron a placas de 96 pocillos de baja unión a ADN (Frame Star 96, semifalda), la concentración de ADN se cuantificó utilizando ADN bicatenario QuantiFluor (Promega) y se normalizó a 1 ng µl−1. La biblioteca de amplicón del gen 16S rRNA se generó como sigue. La amplificación por PCR, la limpieza y la PCR con código de barras se realizaron como en [57]. La concentración de ADN se determinó como se indicó anteriormente y cada pocillo se normalizó a 1 ng µl−1. A continuación, se combinó el mismo volumen de cada pocillo en una biblioteca de amplicones de genes 16S rRNA combinados, y la biblioteca se limpió dos veces con perlas magnéticas AMPure utilizando una proporción de perlas a ADN de 0,9 para eliminar pequeños fragmentos de ADN. La distribución de longitudes de amplicón de la biblioteca se evaluó en una TapeStation 2200 utilizando HS D1000 (Agilent), lo que resultó en un tamaño de biblioteca efectivo de 554–643 pb. La secuenciación se realizó para muestras de 12 p. m. en un secuenciador de escritorio MiSeq (Illumina) en el Centro de Diversidad Genética de Zúrich utilizando el kit de reactivos MiSeq v.3 (extremo emparejado, 2 × 300 pb, 600 cyc PE). La desnaturalización, la dilución y la adición de PhiX al 15 % a la biblioteca de ADN se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron cebadores de secuenciación personalizados como se describió anteriormente [30].

El genoma de cada cepa se obtuvo consultando RefSeq con los números de acceso en Source Data 5. Los genes se mapearon en términos COG usando un mapeador de ponche de huevo y luego todas las cepas se etiquetaron como auxótrofas o protótrofas iterativamente para cada uno de los siguientes compuestos: biotina, tiamina, pantotenato, niacina. El análisis se limitó a los términos del COG para los que se proporciona un mapeo de rutas (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/pathways/). Luego se construyó una tabla de contingencia basada en la presencia de cada término COG en auxótrofos y protótrofos respectivamente. Se realizó una prueba de χ2 en la tabla de contingencia y se almacenaron los valores de p, así como la información sobre qué grupo tenía la mayor presencia de cada término COG. Los valores de p resultantes se corrigieron posteriormente utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Para términos COG significativamente diferentes (valor q < 0,05), se recuperó una anotación funcional de la API de la base de datos COG (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/api/cog/) y se asignó a términos biológicos. proceso a través de KEGG (disponible en Biopython). La eficacia de la corrección de pruebas múltiples se confirmó generando modelos aleatorios mezclando las etiquetas de auxotrofia/prototrofia. Ningún término COG fue significativamente diferente en abundancia entre los auxótrofos y protótrofos asignados al azar.

Para crear modelos para predecir la auxotrofia a partir de anotaciones COG, entrenamos clasificadores de árboles de decisión basados ​​en el proceso de selección de características presentado anteriormente, o términos COG elegidos al azar de cada ruta (500 aleatorizaciones). Primero, agregamos el conjunto de datos de 35 cepas validadas con 28 cepas adicionales de la pantalla de abandono presentada en la Fig. 1 complementaria para disminuir el sesgo de muestreo. Este conjunto total de 63 se dividió en conjuntos de datos de prueba y entrenamiento equilibrados usando el 40 % de los datos para probar usando "train_test_split" y los clasificadores de árboles de decisión se generaron con "DecisionTreeClassifier" de la biblioteca sklearn con una profundidad máxima de tres nodos.

Se aplicaron modelos de recursos de consumidores para analizar el éxito de los auxótrofos en experimentos de cocultivo. Los modelos de recursos de consumo son representaciones de la abundancia de un organismo en función de su capacidad para consumir un recurso determinado. Aquí, aplicamos un modelo de recursos del consumidor para determinar la abundancia de cada cepa bacteriana utilizando su recuento de CFU observado experimentalmente (Tabla complementaria 5), ​​tasa de crecimiento (μ) y rendimiento. La capacidad de carga C para cada cepa se determinó multiplicando su rendimiento máximo determinado experimentalmente por el recuento de CFU por OD (columna CFU/OD en la Tabla complementaria 5). Todos los parámetros se aclaran en la Tabla complementaria 6.

En t = 0, la abundancia de cada cepa (CFU/ml) se estableció en su abundancia observada experimentalmente al comienzo del experimento (la columna de CFU/ml en la Tabla complementaria 7) dividida por 4 (ya que las cepas se mezclaron por primera vez, diluyendo la abundancia de cada cepa por un factor de 20, el inóculo se inoculó en 1/200 en medio fresco y finalmente se multiplicó por 1000 para estimar las UFC/ml).

A continuación, se actualizó la concentración de cada cepa para cada punto de tiempo. Aquí, la tasa de crecimiento de la cepa se actualizó por primera vez de acuerdo con la cinética de Monod.

Donde se supuso que la afinidad del sustrato Ks era proporcional al rendimiento de la cepa (en términos de OD) y se calculó dividiendo el rendimiento máximo de todas las cepas por el rendimiento de cada cepa. Para cada cepa, se formuló una ecuación diferencial ordinaria para describir el cambio en la concentración de esa cepa:

Donde Cstrain es la capacidad de carga o el rendimiento de esa cepa. Estas ecuaciones específicas de la cepa se acoplaron a una ODE que describe el cambio en la concentración de glucosa donde [Glucosa] se fijó inicialmente en 20 mM.

Donde la primera parte debajo de la suma estima la tasa de consumo de glucosa de cada cepa a partir de sus parámetros de crecimiento (tasa de crecimiento multiplicada por 10). A continuación, se estima el consumo total de glucosa a partir de las tasas de consumo y el número de células escaladas a la capacidad de carga. La unidad bajo la suma es h−1. Luego, el modelo se resolvió utilizando el solucionador odeint de scipy.

En t∈{24,48,72,96} se simuló un paso de dilución (1/200) de la siguiente manera:

La capacidad de carga C se determinó para cada cepa por separado como se describe anteriormente. Con base en los datos presentados en la Fig. 5, estimamos que la concentración de vitamina aumentó como máximo 10 veces en presencia de cepas prototróficas. Dado que se complementaron los cultivos con vitaminas 1 µM, repetimos la simulación descrita anteriormente con la capacidad de carga CStrain para cada cepa en función de su rendimiento determinado experimentalmente con vitaminas 10 µM (Fig. 9 complementaria). Para las cepas de las que faltaban datos, se utilizó en su lugar el aumento medio de la capacidad de carga.

La segunda fuente de carbono se simuló estableciendo un flujo de secreción solo para las cepas cuya tasa de crecimiento era mayor que un umbral determinado (que variaba de 0,3 -h a 0,6 h-1). El flujo de secreción se redujo en un 50% a partir de la tasa de captación de glucosa. En t = 0, S2 = 0.

Por lo tanto, la secreción de S2 en el medio por cepas de rápido crecimiento fue controlada por

El cambio en la concentración de [S2] fue entonces

La fórmula para la concentración y la tasa de producción de S2 condujo a un rango de concentración biológicamente realista (~ 5 mM; Fig. 10 complementaria). En el extremo receptor, las tasas de crecimiento de S2 se estimaron de la siguiente manera

Para simulaciones en las que los auxótrofos y los protótrofos eran igualmente eficientes, el parámetro Scaling_factor se estableció en 1/3. Para hacer que los auxótrofos sean más eficientes, el factor de escala se fijó en 1 para los auxótrofos y se mantuvo en 1/3 para los protótrofos. La sensibilidad de este parámetro se probó configurándola en un rango de 1/2 a 2. La concentración de cada cepa se simuló de la siguiente manera:

Donde \(C_{S_{2,\,Strain}}\) se estableció en 70. Este parámetro se estableció en base al hallazgo de que el crecimiento de los subproductos metabólicos puede ser comparable al crecimiento de la glucosa [49].

Las simulaciones se repitieron para el tiempo t∈{1,2,3,…,120}. En t∈{24,48,72,96}, se simuló la dilución como se describe anteriormente.

A menos que se indique lo contrario, todos los análisis se realizaron en una máquina con Windows que ejecuta Python 3.8 a través de Anaconda3 utilizando scripts personalizados. Los datos se manejaron en marcos de datos pandas (V 1.1.3), para el cálculo numérico se utilizó la biblioteca numpy (V 1.20.1), y se realizaron regresiones lineales y corrección de pruebas múltiples a través de los modelos sklearn y stats (V 0.23.0 y V 0.12. 0, respectivamente) implementaciones. Para las pruebas estadísticas, se utilizaron implementaciones de scipy (V 1.5.2). Las API se consultaron a través de solicitudes (V 2.22.0) y KEGG a través de Biopython (V 1.76). Los modelos metabólicos se generaron utilizando CarveMe [33] (V 1.2.2) siguiendo el tutorial publicado (https://carveme.readthedocs.io/en/latest/usage.html). Para datos continuos, se realizó la prueba t o la prueba t de Welch dependiendo de la varianza dentro de cada grupo. Para datos categóricos, se realizaron pruebas de χ2. El número de repeticiones (n) y el tipo de prueba realizada se pueden encontrar en la leyenda de la figura respectiva.

El código relevante utilizado para generar modelos de recursos del consumidor está disponible como material complementario. Los datos de metabolómica de LC/MS sin procesar para sobrenadantes y experimentos de agotamiento están disponibles en MetaboLights https://www.ebi.ac.uk/metabolights/index (ID de acceso MTBLS5309). Los datos de secuenciación sin procesar están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home?show=reads (ID de acceso PRJEB55397).

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Agradecemos a M. Schäfer por su asistencia en la pantalla de auxotrofia, así como por la lectura crítica del manuscrito, a C. Vogel por proporcionar las anotaciones del COG y la evaluación de los análisis filogenéticos, a S. Pfeilmeier por su ayuda en el diseño experimental de los experimentos de cocultivo, D. Demaj y P. Kirner por su asistencia en la preparación de la biblioteca de genes 16S rRNA, T. Stewart y J. Kurmann por su asistencia experimental con los experimentos de titulación de vitaminas. Agradecemos a L. Hemmerle, P. Kiefer y P. Keller por sus útiles debates ya A. Pacheco por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos al Centro de Diversidad Genética de Zúrich y especialmente a S. Kobel por su asistencia técnica y experiencia con respecto a los datos de secuencia, y a C. Field por demultiplexar los datos de secuencia. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (subvención no. 310030B_201265).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich.

Instituto de Microbiología, ETH Zurich, 8093, Zurich, Suiza

Birgitta Ryback, Miriam Bortfeld-Miller y Julia A. Vorholt

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BR y JAV diseñaron el estudio. BR llevó a cabo los experimentos, análisis y modelos. BR y MB-M realizaron experimentos de cocultivo, muestreo y preparación y secuenciación de la biblioteca de amplicón del gen 16S rRNA. BR y JAV escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Julia A. Vorholt.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ryback, B., Bortfeld-Miller, M. & Vorholt, JA Adaptación metabólica a la auxotrofia de vitaminas por bacterias asociadas a las hojas. ISME J 16, 2712–2724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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Recibido: 12 Octubre 2021

Revisado: 13 julio 2022

Aceptado: 25 julio 2022

Publicado: 20 agosto 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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Naturaleza Ecología y Evolución (2022)